يُعد Annexin V-Alexa Fluor 488 أداة بيولوجية شائعة تُستخدم في تحليل تجمعات الخلايا، وخصوصًا لدراسة التغيرات الغشائية خلال مراحل تطور الخلية. يعتمد هذا الكاشف على الارتباط القوي لبروتين Annexin V بالفوسفاتيديل سيرين (PS) وعلى شدة الفلورة واستقرار الصبغة Alexa Fluor 488، مما يمكّن الباحثين من تتبع تغيّرات الغشاء الخلوي بدقة عالية باستخدام أجهزة الفلوسيتومتر (تدفق الخلايا) أو المجاهر الفلورية

في الخلايا السليمة، يتموضع PS في الجهة الداخلية لغشاء الخلية، لكن خلال التغيرات الخلوية، ينتقل PS إلى الجهة الخارجية. ويعد هذا التحول علامة واضحة يمكن استهدافها باستخدام Annexin V

الآلية الجزيئية وخصائص الفلوروفور

Annexin V هو بروتين يعتمد في ارتباطه على الكالسيوم، وله ألفة عالية جدًا تجاه PS. تمتلك صبغة Alexa Fluor 488 قمتي إثارة وانبعاث عند حوالي 495/519 نانومتر، وهي متوافقة مع أجهزة التحليل الضوئي الشائعة، وتُعتبر بديلًا محسنًا عن FITC بسبب مقاومتها للتلاشي وإشارتها الأعلى (مصدر من NIH)

تُستخدم هذه الأداة على نطاق واسع في اختبارات الخلايا عالية الإنتاجية وتسمح برؤية فورية لتغيرات الخلايا أثناء التجارب المخبرية المختلف

التطبيقات في دراسات الخلايا

يُستخدم هذا الكاشف الفلوري في

تحليل التدفق الخلوي المتعدد

تمييز حالات الخلايا وفقًا لتغيرات الغشاء

دراسات التفاعل بين الخلايا والمعالجات الخارجية

نماذج الخلايا الأولية والمعدلة وراثيًا

وغالبًا ما يتم استخدامه مع صبغة PI أو 7-AAD لتمييز الحالات التالية

Annexin V+/PI–: بداية التغيّر الغشائي

Annexin V+/PI+: مراحل متقدمة من التغير

Annexin V–/PI+: اختراق الغشاء فقط

يمكن الاطلاع على بروتوكولات العمل في Harvard وجامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو.

توافق النظام وأنواع الخلايا

تم اختبار هذا الكاشف على أنواع مختلفة من الأنظمة، مثل

الخلايا اللاصقة (Adherent Cells)

خلايا التعليق (Suspension Cells)

تحضيرات الأنسجة وتحاليل الخلية المفردة

نماذج الخلايا الجذعية وخلايا الدم

يمكن الاطلاع على تفاصيل التحضير من جامعة جونز هوبكنز وجامعة ييل

التعويض والتحكم في التحليل

يتطلب استخدام Annexin V-Alexa Fluor 488 في تحاليل الفلوسيتومتر ضبطًا دقيقًا، ويشمل

عينة غير مصبوغة لضبط الخلفية

عينات مصبوغة بلون واحد للتعويض

عينة تحكم من نوع Isotype لضبط البوابة

راجع NCI Flow Cytometry Guide وNCBI Bookshelf لمزيد من المعلومات

بروتوكول العمل

غسل الخلايا مرتين بمحلول PBS البارد

إعادة تعليق الخلايا في محلول الربط الخاص بـ Annexin V

إضافة 5 ميكرولتر من Annexin V-Alexa Fluor 488 لكل 100 ميكرولتر من المعلق الخلوي

الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام

إضافة PI أو 7-AAD والتحليل خلال ساعة واحدة

يمكنك الاطلاع على الإرشادات التفصيلية من جامعة مينيسوتا.

توافق الأجهزة

هذه الصبغة متوافقة مع

أجهزة الليزر 488 نانومتر

مرشحات FITC (530/30 نانومتر)

أجهزة Cytometers متعددة القنوات

أجهزة التصوير الآلي

يمكن الحصول على تفاصيل الدعم من NIH Flow Core Resources وEmory University Cores

شروط التخزين والتعامل

تُخزن عند درجة حرارة 2–8 مئوية، بعيدًا عن الضوء

يجب تجنب التجميد المتكرر

الصلاحية النموذجية بين 6 إلى 12 شهرًا

راجع NIH ChemIDplus وPubChem

اعتبارات تصميم التجارب

لضمان نتائج دقيقة، تأكد من:

استخدام محلول يحتوي على الكالسيوم

تهيئة أدوات التحليل بتعويض مناسب

اختبار تركيز الكاشف قبل البدء

الحذر من التداخل الطيفي في التجارب متعددة الألوان

للحصول على نماذج تصميم تجريبي، راجع جامعة ميشيغان وجامعة بيتسبرغ.

تفسير البيانات

عادةً ما ينتج عن تحليل Annexin V-Alexa Fluor 488 باستخدام الفلوسيتومتر توزيع رباعي

Q1: PI+/Annexin V– (اختراق الغشاء فقط)

Q2: PI+/Annexin V+ (تغيرات متقدمة)

Q3: PI–/Annexin V– (خلايا سليمة)

Q4: PI–/Annexin V+ (بداية التغيّر)

راجع NIH Office of Research Services لمزيد من التفاصيل

الأنواع المتوافقة والمشاكل الشائعة

يعمل هذا الكاشف مع

خلايا الدم المحيطية PBMCs

نماذج الأورام

خلايا معدلة باستخدام CRISPR

تراكيب خلوية ثلاثية الأبعاد

إذا كانت شدة الفلورة منخفضة، تحقق مما يلي

تأكد من وجود الكالسيوم في المحلول

تحقق من توافق الجهاز مع الصبغة

تجنب فترات الحضانة الطويلة

اطلع على نصائح من جامعة آيوا وجامعة واشنطن

كلمات مفتاحية لتحسين محركات البحث (SEO)

annexin v alexa fluor 488 flow cytometry

علامة خلوية خضراء للغشاء

كاشف لتغيرات الغشاء الخلوي

صبغة alexa 488 للخلايا

تحليل annexin v بتدفق الخلايا

assay for membrane lipid exposure

كاشف تغير الغشاء باستخدام الفلور

تحليل PS في الخلايا

alternative to FITC annexin

fluorescent cell labeling without toxicity

تم اختيار هذه الكلمات بناءً على أدوات مثل PubMed، وNIH RePORTER، وGoogle Trends.

روابط إضافية للقراءة

دليل Annexins من مكتبة الطب الوطنية الأمريكية

أدوات من مكتب البحوث التابع للمعاهد الوطنية

دروس NCI في تحليل الخلايا

مواد تعليمية من جامعة ستانفورد

إرشادات السلامة المعملية من CDC

معايير الكواشف الحيوية من FDA